Planteamiento de nuevo diagnostico bacteriano por método molecular

1. Proceso de investigación
2. A través de referencias publicadas en revistas de investigación
3. A través de compra de Kits de diagnostico molecular

    Secuenciación del ADN

    Análisis de los resultados

Reporte de los resultados

Extracción de ADN genómico, o de ADN plasmídico
De una bacteria Salmonella cultivada previamente en agar SS
se toma una colonia y se aplica la técnica de extracción del ADN
Lisis celular,. purificación del ADNg, precipitación del ADN, Lavados, Secado, resuspensión del ADN, almacenaje
Detergentes aniónicos; FCI 25:4:1: precipitación con Et-OH 100% helado; lavados con Et-OH 70%; Secado en estufa a 37°C o expuesto a  UV:  resuspensión con TE 10:1

Aplicación de la técnica de diagnostico por PCR del gen invA de Salmonella spp

Protocolo de detección de Salmonella spp con el gen InvA por PCR
Algoritmo diagnostico

1. Obtener 5 - 10 ml de sangre periférica del paciente
2. Extraer el ADN usando el protocolo por el método de Ebullición Ver Anexo 1
3. Aplicar técnica de diagnostico por PCR normal Ver Anexo 2
4. Analizar los resultado y reportar.

Anexo 1:  Método de extracción de ADN de Salmonella spp por Ebullición a partir de una colonia.

1 Tomar una colonia de Salmonella crecida recientemente en un medio de cultivo

2 Respender en 500ul de agua bidestilada

3 Llevar a ebullición durante 10 min.

4 Luego tomar 5 ul del sobrenadante para la PCR

Anexo 2: PCR

1 Realizar la PCR con 5 ul del ADN extraído

2 Preparar el master mix

    Preparación del Master Mix.
Agua
Tampón (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 9, Tritón X-100 al 0,1%, 0,01% de gelatina)
ClMg (MgCl2 2 mM)
dNTPs (0,2 mM x c/u)
Primer1: (1 µM) S141.TCATCGCACCGTCAAAGGAACC
Primer2: (1 µM) S139-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA
ADNpol: 1UI
Muestra ADNg  5ul (Paciente, Control + 1 ul, Control - 1ul)
Volumento Rxn = 50ul

3 Programa del Termociclador

Condiciones del programa de PCR
                                                          Temp              Tiempo    #Ciclos
        Pre-desnaturalización       94°C                  10min

                    Desnaturalización        94°C              1 min
                    Hibridación                     60°C             1 min           30
                    Polimeración                  72°C             2 min

        Extensión de la polimeración 72°C 10 min
        Conservación                                      4°C x  24horas

4  Migrar los productos de PCR en un gel de electroforesis preparado con agarosa al 1%

5  Verificar la amplificación de PCR en un fotodocumentador de transiluminación de UV

6 Se la banda de amplicón esta presente en un tamaño de  284 pb se considera positivo

APLICACION DE RFLP

Preparación de reactivo

Agua UP                                              -                   32ul

Tampón de le ER 5X                        1x                    10ul 

Enzima de Restricción ( ? UI)        1UI                   3ul          

Muestra de ADN prod de PCR (Amplicon)        5ul            5ul   

                                                                                    50ul

Poner a incubar 37°C por 1 hora

Parar la reacción 60°C

Hacer la electroforesis para ver verificar las bandas

Analizar el resultado

7 Entregar el reporte al paciente